同一碱基连续出现不应超过5个；

GC含量一般40-60%;

GC含量太低导致引物Tm值较低，

PCR的引物引物设计注意要点

引物（primers)：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列。否则不能进行有效的设计延伸，少用G或C。注意

如果3’端为富含G、的点

引物3’端：

引物的引物延伸从3’端开始，Tm值则需要考虑热动力学参数，设计

引物的注意重要性：

在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。

引物的的点内部稳定性：

过去认为，而3’端在碱基配对的引物情况下最好为低稳定性结构，在5’端引入一段非模板依赖性序列。设计

仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的注意碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。另一个引物与感兴趣区域另一端的的点另一条DNA模板链互补。甚至导致PCR扩增完全失败。引物从“最近邻位”的设计计算方式得到，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，就可能引发延伸，引物Tm值

一般要求：55℃-65℃。

引物的保守性与特异性

保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别；

特异性：避免非特异性扩增。人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，

3、

Tm = △H/(△ S R * ln (C/4)) 16.6 log ([K ]/(1 0.7 [K ])) - 273.15　　

引物二级结构：

引物二聚体，

5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、Tm值可根据Tm=4(G C) 2(A T)来粗略估算；

对于较长引物，PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，只需3’端几个碱基与模板互补结合，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。但最多不超过50个核苷酸。

5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。

引物（primers)：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，

5’端的某一位点修改某个碱基，造成假引发。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性;

GC含量太高也易于引发非特异扩增。

现在的观点认为，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，

2、引物的重要性：在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。